千亿球友会在成熟的心肌细胞中，高效的兴奋-收缩偶联（excitation-contraction coupling，ECC）依赖于结构和功能完整的二联体（dyad）单元：由横管（T-tubule）和连接型肌浆网（junctional sarcoplasmic reticulum，jSR）偶联在Z线形成规则排列的纳米级结构。T-tubule为心肌细胞质膜的管状凹陷，膜上分布着电压敏感型钙通道；jSR是富含 Ca2+释放通道RYR2（Ryanodine Receptor 2）的肌浆殊区域。dyad紧密地将电活动与Ca2+释放和心肌收缩联系在一起，其结构异常和功能紊乱直接导致ECC缺陷，是源于不同病因心力衰竭患者的共同特征。
人源诱导型多能干细胞分化的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）未能形成dyad，这限制了其在疾病建模和组织修复中的应用。因此，促进dyad的组装和稳定的方法有望保护心脏免受重塑和心力衰竭的影响，并提高hiPSC-CM的研究和治疗潜力。
该研究揭示了心力衰竭的重要致病机制——CMYA5表达水平降低，并开发了一种可通过腺相关病毒（AAV）载体递送的微型化CMYA5蛋白（miniCMYA5）。心脏特异性表达miniCMYA5稳固了dyad的结构，显著改善心脏功能，并在hiPSC-CM中启动了dyad的组装，为心力衰竭的治疗和hiPSC-CM的体外成熟提供了新方法。
在之前的研究中，研究团队使用生物素介导的邻近蛋白质组学标记技术（BioID），在活体、原位成功捕获了位于dyad空间的蛋白质组，发现了新型dyad蛋白CMYA5是调控jSR定位于Z线（dyad组装的早期和关键步骤）的重要分子。CMYA5缺失破坏了dyad结构、dyad在Z线上的定位以及jSR 的Ca2+释放，导致心力衰竭和对压力超载应激的不耐受。通过检测主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）后小鼠和扩张型心肌病患者的心脏样本发现， CMYA5转录水平和定位正常，但与RYR2互作的CMYA5蛋白水平显著下调，成为心力衰竭中dyad结构破坏的重要因素。因此，增强CMYA5蛋白表达可能有助于保护dyad结构，抵抗和治疗心力衰竭。
AAV是主要的活体心脏基因递送载体， 但其容量有限（~4.7 kb），无法用于表达全长的CMYA5（长达11.2 kb）。为此，研究团队设计了一种可以通过AAV递送的CMYA5衍生物，分析不同物种中CMYA5氨基酸的保守性发现，N端（78-319，NT）和C端（2731-3739，MD9）高度保守。免疫荧光和免疫共沉淀实验表明，NT负责CMYA5的Z线 缺失的心肌细胞中，NT和MD9单独均无法恢复RYR2的定位。相反地，研究团队将NT融合到 MD9后，产生了足够小、AAV可装载的微型化蛋白——miniCMYA5，能够定位于Z线的定位。进一步功能评估表明，miniCMYA5能有效替代全长 CMYA5，修复由于CMYA5缺失引起的dyad组装、Z线定位和心脏功能方面的紊乱。
在随后的实验中，研究团队采用两套方案测试AAV-miniCMYA5的治疗潜力：一是在新生小鼠注射全剂量AAV，成年后进行TAC手术，测试其抵抗心力衰竭的能力；二是对成年鼠进行TAC手术建立心力衰竭模型后进行AAV注射，验证治疗效果。通过超声心动图监测心脏功能、组织原位成像、免疫组化分析以及对单个心肌细胞进行收缩力和钙成像等操作，全面评估基因治疗效果。结果显示，通过 AAV-miniCMYA5增强CMYA5活性能稳定dyad结构，纠正异常的Ca2+释放，缓解心肌肥厚和功能障碍。与以往基于Junctophilin2 和Bin1的治疗策略相比，miniCMYA5展现出了更为优越的效果，是一种更具潜力的新型治疗心力衰竭的手段。
最后，对体外分化的iPSC-CM和健康供体的成熟心肌进行对比分析发现， CMYA5及其互作蛋白在转录和蛋白水平的缺失，可能是hiPSC-CM结构不成熟的重要因素。结合细胞微图案（micropattern）和工程化人源心肌组织（engineered heart tissue，EHT）技术，在hiPSC-CM中表达miniCMYA5促进了RYR2/jSR与Z线的对齐，增加了钙释放的同步性和钙瞬变的幅度，同时提高了EHT的收缩力。miniCMYA5技术成为首个通过基因操纵促进hiPSC-CM结构和功能成熟的手段。
复旦大学路福建研究员为该论文第一作者和共同通讯作者，波士顿儿童医院William Pu教授为论文共同通讯作者。此外，该研究还得到了中山大学吴泽璇博士，湖北大学张冬卉教授课题组，西安交通大学谢文俊教授，波士顿大学 Francisco Naya教授，宾夕法尼亚大学Kenneth Margulies教授课题组，哈佛大学Kit Parker教授课题组，加拿大卡尔加里大学Wayne Chen教授的帮助和支持。
原标题：《Nature子刊：路福建等开发心力衰竭治疗新手段和体外心肌细胞成熟新技术》
